1、確定參數(shù)：實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控部門一般會(huì)告知能力驗(yàn)證樣品基本信息。我們實(shí)驗(yàn)是參數(shù)是單核增生李斯特。
2、確定檢測(cè)方法：GB 4789.30定性檢驗(yàn)。
3、確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方案：把所涉及的試劑進(jìn)行排查，查詢是否缺某種試劑；整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程按思路整理下來，便于實(shí)驗(yàn)操作時(shí)記錄每天實(shí)驗(yàn)完成情況及結(jié)果。
4、配置所需培養(yǎng)基：無菌水、FB1、FB2、PALCAM、單增顯色板、TSA-YE等。
二、實(shí)驗(yàn)操作
1、閱讀說明書，水化凍干粉（如下圖）
注意事項(xiàng)：多多少少做了好幾次能力驗(yàn)證，這里水化時(shí)建議提前準(zhǔn)備無菌三角瓶或者無菌袋，分四次水化安培瓶，每次5mL。最后水化共計(jì)40mL混勻備用。
開取西林瓶時(shí)，注意盲樣狀態(tài)是否完好，若是灑落，記得拍照留下證據(jù)。
2、實(shí)驗(yàn)步驟
2.1吸取25ml水化的樣品加入225mL的FB1培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h。
注意事項(xiàng)：在這里，我們可以先分別分離菌落在PALCAM、單增顯色板上， 36℃培養(yǎng)24-48h.看是否有雜菌或者是否無菌生長，給后面實(shí)驗(yàn)提供信息（如下圖左），同時(shí)需要帶上單核增生李斯特標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC19115（如下圖右），以及單增系列的輔助標(biāo)準(zhǔn)菌株（見后面）。
這里我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：一個(gè)平板無菌生長；一個(gè)平板菌落典型藍(lán)紫色，類似標(biāo)準(zhǔn)菌株。
2.2 從FB1培養(yǎng)基吸取0.1mL加入LB2培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h。
2.3 從FB2培養(yǎng)基中挑取一環(huán)分離在PALCAM、單增顯色板上，培養(yǎng)36℃24-48h，對(duì)比之前未選擇性增菌的PALCAM、單增顯色板。
注意事項(xiàng)：一般定性檢測(cè)會(huì)加干擾菌，經(jīng)過FB1 FB2的選擇性增菌，既增加了單增的目標(biāo)菌，又抑制了雜菌，所以這一步很重要。經(jīng)過選擇性增菌后實(shí)驗(yàn)結(jié)果：一個(gè)平板淡黃色、圓形、光滑、濕潤；一個(gè)平板菌落典型藍(lán)紫色，類似標(biāo)準(zhǔn)菌株.
2.4 初篩
自選擇性瓊脂平板上分別挑取3個(gè)~5個(gè)典型或可疑菌落,分別接種木糖、鼠李糖 發(fā)酵管,于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)24h±2h,同時(shí)在 TSA-YE平板上劃線,于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,然后選擇木糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。
挑取一單獨(dú)菌落分別接種木糖與鼠李糖，如下圖：
注意事項(xiàng)：以上圖片為單增標(biāo)準(zhǔn)菌株以及各種輔助標(biāo)準(zhǔn)菌株的木糖、鼠李糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果。然后選擇木 糖陰性、鼠李糖陽性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。
2.5 鑒定
2.5.1 用上述的平板進(jìn)行生化鑒定實(shí)驗(yàn)，按照試劑條說明書進(jìn)行和標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)比如下：
2.5.2 染色鏡檢：革蘭氏陽性短桿菌，如下圖：
注意事項(xiàng)：右圖是左圖藍(lán)色區(qū)域的放大。
2.5.3 動(dòng)力試驗(yàn)挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落穿刺半固體SIM 動(dòng)力培養(yǎng)基,于25 ℃~30 ℃培養(yǎng) 48h,李斯特氏菌有動(dòng)力,在半固體或 SIM 培養(yǎng)基上方呈傘狀生長,如傘狀生長不明顯,可繼續(xù)培養(yǎng) 5d,再觀察結(jié)果。
2.5.4 生化鑒定:挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落,進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn),過氧化氫酶陽性反應(yīng)的菌落繼續(xù) 進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)和 MR-VP試驗(yàn)。過氧化氫酶試驗(yàn)：陽性，如下圖：
注意事項(xiàng)：A是空白，B、C是陽性反應(yīng)。
2.5.5 溶血試驗(yàn)：
單增李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)；斯氏李斯特氏菌在刺種點(diǎn)周圍產(chǎn)生狹小的透明溶血環(huán)；英諾克李斯特氏菌無溶血環(huán)；伊氏李斯特氏菌產(chǎn)生大的透明溶血環(huán)。
如下圖：
注意事項(xiàng)：單核增生李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌的接種端溶血增強(qiáng)；斯氏李斯特氏菌的溶血也增強(qiáng)；伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌的接種端溶血增強(qiáng)。
2.6 結(jié)果與報(bào)告 綜合以上生化試驗(yàn)和溶血試驗(yàn)的結(jié)果,報(bào)告40mL樣品中檢出或未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
